Общие принципы гистологических методов

При проведении практически любых микроскопических исследований критически важна правильная подготовка исследуемого материала. Лишь при соблюдении необходимых условий возможно получить хороший результат. К сожалению, не существует единого протокола для всех методов исследования. Для получения наилучшего результата для каждого конкретного метода исследования требуется специфическая подготовка материала. Кроме того, существенную роль играет сам исследуемый объект, до такой степени, что во многих случаях протокол пробоподготовки приходится существенно изменять в зависимости от свойств изучаемого организма. Например, животные, обладающие плотной кутикулой, такие как членистоногие или нематоды, для получения качественных гистологических препаратов требуют специальных методов фиксации, заливки и резки, связанных с жесткостью покровов тела и затрудненным проникновением веществ, используемых в процессе пробоподготовки.

В связи с перечисленными особенностями, для каждой из методик исследования существует большое количество различных вариантов рабочих протоколов и их модификаций. Наиболее распространенные и хорошо зарекомендовавшие себя методы пробоподготовки при приготовлении гистологических препаратов собраны в специальные руководства (Ромейс, 1953; Пирс, 1956; Росскин, Левинсон, 1957; Лилли, 1969). В задачи данного раздела не входит подробное описание всего многообразия микроскопических методов. Здесь представлены основные принципы пробоподготовки, наиболее характерные для большинства нейрогистологических методик.

Минимальная пробоподготовка требуется при проведении прижизненных исследований. Чаще всего она заключается лишь в иммобилизации объекта для рассмотрения под микроскопом, а также в предварительной инкубации объекта в растворе красителя, либо в инъекции красителя в исследуемые клетки или ткани. Преимуществом прижизненных наблюдений является возможность непосредственного исследования живого функционирующего организма, а также возможность постановки прямых экспериментов. Сложностью данного типа исследования является необходимость поддержания жизнеспособности подопытного организма на всем протяжении исследования. Это возможно далеко не всегда и в ряде случаев требует использования специального оборудования.

Гораздо более сложная подготовка материала необходима при изготовлении тотальных препаратов и гистологических срезов, использовании электронного и конфокального микроскопов. К сожалению, несмотря на очевидные преимущества этих методов, каждый из них имеет ряд ограничений, которые необходимо учитывать при планировании исследования. Часть этих ограничений связана и с подготовкой образцов. Кроме того, несоблюдение правил пробоподготовки может привести к появлению артефактов или полной негодности полученного результата к исследованию. Именно поэтому необходимо понимать физические принципы, лежащие в основе работы используемого метода и процессы, происходящие с объектом исследования при пробоподготовке.

Существует много различных модификаций метода гистологической пробоподготовки, однако основной принцип остается неизменным. Классическая гистологическая пробоподготовка состоит из пяти основных этапов:

1. Фиксация
2. Уплотнение
3. Изготовление срезов
4. Окрашивание
5. Просветление препаратов и заключение под покровное стекло с целью приготовления временных или постоянных препаратов для дальнейшего исследования.

Практически при любом неприжизненном микроскопическом исследовании биологического материала возникает ряд проблем. Первая из них связана с тем, что после смерти организма, в его клетках практически сразу начинаются необратимые процессы разрушения, которые очень быстро делают объект непригодным для исследования. Чтобы этого избежать используют специальные вещества – фиксаторы, которые проникают в клетки и стабилизируют их структуру. В большинстве случаев фиксаторы представляют собой токсические вещества и обращаться с ними следует крайне осторожно. Кроме того, перед препаровкой организмов и фиксацией живого материала необходимо применять специальные методы анестезии, чтобы максимально обезболить животное и предотвратить развитие у него стрессовой реакции и непроизвольного сокращения мускулатуры.

Чаще всего фиксация осуществляется путем погружения исследуемых организмов или кусочков их тканей и органов в фиксатор на определенное время. Для получения хороших результатов довольно важно выдерживать оптимальное соотношение объема фиксатора к фиксируемому объекту. Объем фиксатора должен превышать объем фиксируемого объекта по крайней мере в 10 раз (а лучше в 30 или 50 раз). Кроме того, фиксатор проникает в ткани не мгновенно, поэтому при работе с крупными объектами качество фиксации внутренних органов и тканей может оказаться гораздо хуже наружных. В таких случаях рекомендуется препарирование объектов перед фиксацией и фиксирование образцов меньшего размера. Фиксация является химическим процессом, и сама по себе вызывает определенные изменения в объекте, которые необходимо учитывать при дальнейших обработках и подбирать фиксатор сообразно предполагаемому методу исследования.

Наиболее часто используемые фиксирующие смеси, дающие хорошие результаты при фиксации нервной ткани:

1. 4% параформальдегид на 0.1 М фосфатном буфере с pН 7.4. Фиксация небольших кусочков ткани и мелких беспозвоночных животных 12–18 ч
2. Фиксатор Буэна – свежеприготовленная смесь, включающая:
1. насыщенный раствор пикриновой кислоты на дистиллированной воде – 15 частей
2. 40% нейтральный формалин – 5 частей
3. ледяная уксусная кислота – 1 часть

Фиксация небольших кусочков ткани и мелких беспозвоночных животных 12–18 ч

3. Фиксатор Жандра – свежеприготовленная смесь, включающая:
1. насыщенный раствор пикриновой кислоты на 96% этиловом спирте – 85 частей
2. 40% нейтральный формалин – 10 частей
3. ледяная уксусная кислота – 5 частей

Фиксация небольших кусочков ткани и мелких беспозвоночных животных 12–18 ч.

4. Фиксатор Стефанини – может храниться некоторое время до употребления в холодильнике, включает:
1. 2% параформальдегид на 0.1 М фосфатном буфере – 85 частей
2. насыщенный раствор пикриновой кислоты на дистиллированной воде – 15 частей

Желательно через 1–3 ч после начала фиксации сменить фиксирующий раствор. Возможно хранение объекта во второй смене фиксатора в холодильнике около 1–2 месяцев.

Для исследования внутреннего строения организма, изучения тканевой и клеточной организации органов зачастую недостаточно изготовления тотальных препаратов, требуется изготовление относительно тонких срезов объекта. Срез должен быть недеформирован и иметь равномерную толщину. Если изготовить непрерывную серию срезов, то с её помощью можно реконструировать трехмерное строение исследуемого объекта. Несмотря на то, что в процессе фиксации происходит частичное уплотнение тканей, объекты без дополнительной обработки остаются все еще слишком мягкими и при попытке изготовления срезов сильно сминаются. Для получения высококачественных срезов необходимо произвести дополнительное уплотнение фиксированного материала. Достигается это за счет заливки в специальные среды. В процессе заливки происходит пропитка образца заливочной средой. В зависимости от задач исследования и необходимости получения срезов определенной толщины подбирают соответствующую среду для уплотнения объекта. Наиболее часто используют среды на основе парафина, целлоидина, а также специальные полимерные смолы. Для исследования общей организации объекта подходят стандартные гистологические срезы толщиной 5–10 мкм, которые делают на микротоме после пропитывания объектов парафином (рис. 1).

При необходимости выявления трехмерной организации нервной сети, общей архитектоники и взаимосвязей между группами нервных элементов скорее подойдут толстые срезы толщиной 50–200 мкм, которые можно получить после предварительного пропитывания и заключения объектов в целлоидин. Полимерные смеси используются чаще для получения так называемых полутонких срезов, толщиной около 1 мкм, что также бывает необходимо при решении определенных задач.

Поскольку большинство заливочных сред не смешивается с водой, а фиксаторы представляют собой водные растворы, необходимо произвести предварительную дегидратацию объекта, а также его пропитку промежуточной жидкостью, способной легко смешиваться с заливочной средой. Чаше всего используют парафиновые заливочные среды, которые при комнатной температуре затвердевают, поэтому процесс пропитки ими образцов производят при температуре 56°С в термостате.

В результате заливки получается плотный блок из заливочной среды с помещенным внутрь объектом исследования. Такие блоки пригодны для изготовления срезов с использованием специального прибора – микротома. Механизм микротома обеспечивает получение серии срезов одинаковой толщины. Хорошо залитые образцы при резке не должны сминаться или крошиться, тем не менее, возможна незначительная деформация полученных срезов. Чтобы от нее избавиться, срезы расправляют на поверхности теплой воды, налитой на предметные стекла. Для этих целей обычно используют особые приборы – термонагревательные столики, которые поддерживают постоянную температуру 36°С. После расправления вода с предметных столиков удаляется, а срезы приклеиваются к предметным стеклам.

Возможно также получение срезов исследуемого объекта в результате резки на замораживающем микротоме (рис. 2) или вибротоме. В первом случае отмытые от фиксатора объекты пропитываются раствором сахарозы и заключают в раствор желатины или специальную смесь Tissue-Tec. Во втором случае объекты заключают в раствор гуммиарабика.

Полученные в результате резки гистологические срезы обычно бесцветны, для выявления на них деталей тканевого и клеточного строения применяют специальные способы окрашивания. Большинство гистологических красителей водорастворимы, поэтому для окрашивания срезы освобождают от заливочной среды, и регидратируют путем проведения по серии спиртов с понижающейся концентрацией. Существует большое количество различных способов окраски, описанных в специальных руководствах. Выбор способа окрашивания зависит от задач исследования. Для изучения общей гистологии объекта, в том числе и различных отделов нервной системы, обычно используют методы окрашивания гематоксилин-эозином, железным гематоксилином, толуидиновым синим, азаном по Гейденгайну, по методу Маллори. С результатами этих окрасок можно ознакомиться в разделе Изображения на примере препаратов, представленных в нашем Атласе.

Для приготовления постоянных препаратов предметные стекла с окрашенными срезами вновь проводят по спиртам теперь уже возрастающей крепости и просветляют. Для чего обычно используют органические растворители – ксилол, бензол или метилбензоат (метилсалицилат). После этого срезы покрываются смолой (используют обычно канадский бальзам или даммаровую смолу), на которую накладывают покровное стекло. Такие препараты могут храниться десятилетиями, не теряя своего качества. В представленных в нашем Атласе коллекциях имеются гистологические препараты академика А.А. Заварзина, которым уже более 100 лет.

Далее препараты исследуют обычно с привлечением светооптической микроскопии (рис. 3).